注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
Lipase(Candida)4-（2-羥乙基）哌-1-2-羥基磺酸單鈉鹽 BC月桂酸 ≥98%, FCC, FG

CAT羥乙基磺酸 80%月桂酸 GR，99%

Lysozyme(Chinken egg)羥乙基磺酸銨鹽 99%月桂酸 分析標(biāo)準(zhǔn)品,>99.5%(GC)

Lysostaphin3-十二烷氧基胺 99%月桂酸 CP，97%

Lysozyme chloride3-(N-啉)磺酸鈉 99.5%(T)月桂酸 standard for GC, ≥99.5% (GC)

Cellulase(Trichoderma Vride G)用于細(xì)胞培養(yǎng), ≥99.5% (T))月桂酸 AR，98%

Cellulase Ozuke R-10十四烷基*基溴化銨 99%肉豆蔻酸甲酯 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥99.5% (GC)

Hemicellulase十四烷基*基溴化銨 離子對(duì)色譜級(jí)，≥99.0% (AT)肉豆蔻酸甲酯 ≥98%

β-Glucuronidase 嗎啉乙磺酸,一 分子生物學(xué)級(jí), ≥99% (T)肉豆蔻酸甲酯 98%

苦杏仁苷酶β-Glucosidase from almonds3-(N-啉)磺酸 99%十四酸 98%

Maltase3-(N-啉)磺酸 分子生物學(xué)級(jí), ≥99.5% (T)棕櫚酸甲酯 97%

Proteinase(Bacillus subtilis)嗎啉乙磺酸鈉鹽 99%棕櫚酸甲酯 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥99.0% (GC)

Lactic dehydrogenase(rabbit muscle)3-磺基十四烷基二甲甜菜堿 98%棕櫚酸甲酯 standard for GC，≥98.0% (GC)

Collagenase嗎啉乙磺酸 99%棕櫚酸甲酯 99%（GC)

Hyaluronidase嗎啉乙磺酸  分子生物學(xué)級(jí)，≥99.5% (T)壬基酚聚氧乙烯(NP 40) ~10% in H2O

POD嗎啉乙磺酸 植物細(xì)胞培養(yǎng)級(jí), ≥99.5%正辛 AR,99.0%

2-丁酮(標(biāo)準(zhǔn)品)IQGAP1 (D6E3J) Rabbit mAbOCEL1  緊密連接蛋白/小分子膠原蛋白OCEL1抗體

丁基三氯化錫(標(biāo)準(zhǔn)品)Di-Methyl-Histone H3 (Lys36) (C75H12) Rabbit mAbOCC1  結(jié)腸癌過(guò)度表達(dá)蛋白1抗體

鄰苯二甲酸二(2-甲氧基)酯(標(biāo)準(zhǔn)品)Di-Methyl-Histone H3 (Lys36) (C75H12) Rabbit mAbOAT4L/URAT1  尿酸鹽重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子1抗體

滅草松標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.100mg/ml,，溶劑：酮)Phospho-PLCbeta3 (Ser537) (D8K2R) Rabbit mAbOAT-3  陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3抗體

1-正丁氨酰-2-苯并咪唑氨酸甲酯(97%)ASF1B (C70E2) Rabbit mAbOAT-1/SLC22A6  陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1抗體

硫標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.100mg/ml)p70 S6 Kinase Substrates Antibody Sampler KitOAT-1/SLC22A6  陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1抗體

丁草胺標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.100mg/ml)Phospho-IRF-3 (Ser396) (D6O1M) Rabbit mAbOAS1  寡腺苷酸合成酶-1

丁草胺(標(biāo)準(zhǔn)品)VEGF Receptor 2 Control ProteinsNYS48  NYS48蛋白抗體

丁草胺標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/ml,u=4%)IKKε (D20G4) Rabbit mAbNXPH2  神經(jīng)外營(yíng)養(yǎng)蛋白2抗體

丁草胺標(biāo)準(zhǔn)溶液(10μg/ml,u=7%)IKKε (D20G4) Rabbit mAbNXPH1  神經(jīng)外營(yíng)養(yǎng)蛋白1抗體
巴布亞旋毛蟲PCR檢測(cè)試劑盒廠家5-Nitroindole多肽試劑　1G

4-Methylindole多肽試劑　1G

4-Chloroindole多肽試劑　1G

7-Methylindole,≥98.0%多肽試劑　1G

6-Methylindole,≥98.0%多肽試劑　250MG

3-Indoleacetonitrile,≥96.0%多肽試劑　5G

5-Amiindole ,≥97.0% (HPLC)多肽試劑　250MG

1,1,2-Trimethylbenz[e]indole多肽試劑　5G

2,3,3-Trimethylindolenine ,≥98.0 %多肽試劑　5ML

7-Amiindole ,≥98.0% (HPLC)多肽試劑　100MG

5-Methylindole,≥99.0%多肽試劑　1G

5-Hydroxyindole,≥98.0%多肽試劑　250MG

Indole-3-carbil,≥96.0%多肽試劑　1G

4-Hydroxyindole, ≥99.0%多肽試劑　1G

Skatole多肽試劑　25G
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。